|
 Nguyễn Minh Nam
I. Lý thuyết
1.1. Giới thiệu khái quát về Nitơ – protein
Tất cả các dạng nitơ có trong cơ thể hay trong các mô được gọi là nitơ tổng số. Nitơ có trong thành phần axit amin của protein là N protein. Nitơ không có trong thành phần protein như các muối đạm vô cơ, axit nitric, các axit amin tự do, ure và các dẫn xuất của ure, các alcaloit, các bazơ purin và pyrimidin…là các nitơ phi protein.
Nitơ tổng số = nitơ protein + nitơ phi protein
1.2. Phương pháp lấy mẫu
Lấy mẫu sản phẩm để kiểm nghiệm là khâu đầu tiên và rất quan trọng trong công tác kiểm nghiệm. Việc lấy mẫu đúng quy cách sẽ góp phần cho kết quả kiểm nghiệm và xử lý sau này đúng đắn. Vì trong thực tế, chỉ lấy một lượng mẫu rất nhỏ để kiểm nghiệm mà kết quả lại được dùng để đánh giá một cách khách quan chất lượng sản phẩm có khối lượng rất lớn.
Vì vậy khi lấy mẫu chúng ta cần thực hiện các quy định dưới đây:
+ Mẫu thực phẩm phải có đủ tính chất đại diện cho cả lô hàng thực phẩm đồng nhất.
+ Trước khi lấy mẫu cần kiểm tra tính đồng nhất của lô hàng, xem xét các giấy tờ kèm theo, đối chiếu nhãn trên bao bì, để riêng các sản phẩm có bao bì không còn nguyên vẹn (rách, thủng, vỡ, mất nhãn,…) phân chia số còn lại thành lô hàng đồng nhất.
+ Đối với sản phẩm ở thể rắn: Cần chú ý đến sự không đồng đều về kích thước của sản phẩm, phải lấy cả sản phẩm có kích thước lớn và kích thước bé. Thường ta tiến hành chia điểm để lấy mẫu tuỳ theo hình dạng của đơn vị chứa sản phẩm.
+ Đối với sản phẩm vừa ở thể rắn, vừa ở thể lỏng không đồng nhất khi lấy mẫu, lấy ở các vị trí khác nhau nhưng phải lấy cả phần rắn, cả phần lỏng theo đúng tỉ lệ của chúng ở trong sản phẩm.
+ Đối với sản phẩm dạng sệt đồng nhất, khuấy kỹ và lấy mẫu đều ở các vị trí khác nhau.
+ Đối với sản phẩm được đóng trong hộp, chai, lọ hoặc bao gói trong túi…thì lấy mẫu cả bao gói.
1.3. Các phương pháp phân tích Protein
1.3.1 Định lượng Protein bằng phương pháp Lowry
+ Nguyên tắc: Dựa vào phản ứng màu của protein và thuốc thử Folin, cường độ màu của dung dịch tỷ lệ thuận với nồng độ protein, và dựa vào đường chuẩn của protein, có thể tính được hàm lượng protein của mẫu nghiên cứu.
1.3.2 Định lượng Protein bằng phương pháp Coomassie Brilliant Blue G – 250
+ Nguyên tắc: Phương pháp này dựa vào sự thay đổi màu xảy ra khi Coomassie Brilliant Blue G – 250 liên kết với protein trong dung dịch axit. Dạng proton hoá của thuốc nhuộm Coomassie Blue có màu đỏ da cam. Thuốc nhuộm liên kết chặt chẽ với các protein, tương tác với cả nhóm kỵ nước và các nhóm mang điện tích dương trên phân tử protein. Trong môi trường của các gốc mang điện tích dương, sự proton hoá không xảy ra và có màu xanh xuất hiện.
1.3.3 Định lượng Protein bằng phương pháp quang phổ
+ Nguyên tắc: Phát hiện và đo protein: Phương pháp đơn giản nhất để đo nồng độ protein trong dung dịch là độ hấp thụ tia cực tím của nó. Nếu protein tinh sạch thì nồng độ tuyệt đối của nó được tính theo giá trị được đo. Nếu protein không tinh sạch thì nồng độ của protein tổng số được tính tương đối từ độ hấp phụ.
1.3.4 Định lượng Protein bằng phương pháp Dumas
+ Nguyên tắc: Phương pháp đốt cháy Dumas để xác định protein thô. Quy trình dùng một thiết bị lò điện đun nóng mẫu phân tích lên đến 600oC trong một lò phản ứng được bịt kín với sự hiện diện của oxy. Hàm lượng nitơ của khí đốt sau đó được đo bằng cách dùng máy dò dẫn nhiệt. Mỗi lần xác định chỉ cần khoảng 2 phút.
1.3.5 Định lượng N - Protein bằng máy Kjeldahl
1.3.5.1 Nguyên tắc của quá trình phân tích
Mẫu được vô cơ hoá bằng H2SO4đđ ở nhiệt độ cao và có chất xúc tác. Các phản ứng của quá trình vô cơ hoá mẫu xảy ra như sau:
2H2SO4 2 H2O + 2SO2 + O2
Oxy tạo thành trong phản ứng lại oxy hoá các nguyên tố khác. Các phân tử chứa nitơ dưới tác dụng của H2SO4 tạo thành NH3. Các protein bị thuỷ phân thành axit amin. Cacbon và hydro của axit amin tạo thành CO2 và H2O, còn nitơ được giải phóng dưới dạng NH3 kết hợp với axit H2SO4 dư tạo thành (NH4)2SO4 tan trong dung dịch.
2NH3 + H2SO4 (NH4)2SO4
Các nguyên tố khoáng khác như P, K, Ca, Mg,…chuyển thành dạng oxit: P2O5, K2O, CaO, MgO…tuy tồn tại trong dung dịch mẫu nhưng không ảnh hưởng đến kết quả phân tích.
Đuổi amoniac ra khỏi dung dịch bằng NaOH.
(NH4)2SO4 + 2NaOH = Na2SO4 + H2O + 2NH3
NH3 bay ra cùng với nước sang bình hứng. Bình hứng có chứa H3BO3 do đó NH3 bay ra sẽ tác dụng ngay với H3BO3 theo phản ứng:
2NH3 + 2H2O + 4H3BO3 = (NH4)2B4O7 + 7H2O
Lượng (NH4)2B4O7 được xác định thông qua việc chuẩn độ bằng HCl 0,25N cho đến khi dung dịch chuyển sang màu hồng nhạt và không bị mất màu.
1.3.5.2. Những yếu tố có thể ảnh hưởng đến kết quả phân tích
+ Nồng độ HCl 0,25N không đảm bảo chính xác
+ Lấy mẫu không đại diện
+ Cân mẫu không chính xác
+ Nguồn nước bị nhiễm N
1.3.5.3 Khả năng ứng dụng của phương pháp Kjeldahl
Phương pháp này có khả năng ứng dụng cho hầu hết các loại mẫu:
+ Mẫu thực phẩm: thuỷ hải sản, nước mắm, các loại đậu, thức ăn nuôi tôm cá, rau quả…
+ Đất, nước thải
+ Bã men bia, bánh dầu đậu nành, bánh dầu cao su…
1.4. Nguyên tắc hoạt động của máy Kjeldahl
Mẫu được đưa vào bồn đốt (hệ thống vô cơ hoá mẫu) thông qua các ống Kjeldahl à Sau khi vô cơ hoá mẫu xong, toàn bộ mẫu + ống Kjeldahl được đưa qua hệ thống chưng cất NH3 à toàn bộ sản phẩm được đưa qua thiết bị chuẩn độ à Kết Quả.
II. Thực Hành
2.1. Qui trình
Phân tích mẫu đậu phộng:
Bước 1: Chuẩn bị mẫu
-Mẫu hạt được nghiền mịn
-Sấy mẫu ở 80oC cho đến khi đạt trọng lượng không đổi
Bước 2: Vô cơ hoá mẫu
-Cân 0,3 – 1 g mẫu khô đã được nghiền mịn.
-Cho mẫu vào tận đáy của ống Kjeldahl (chu ý không để dính trên thành ống)
-Cho 5g hỗn hợp xúc tác K2SO4 và CuSO4 theo tỉ lệ 10:1
-Dùng pipet hút 15ml H2SO4 đậm đặc (d=1,84) cho vào ống vô cơ hoá mẫu có chứa hỗn hợp trên.
-Lắp ống trên vào hệ thống vô cơ hoá mẫu.
-Việc vô cơ hoá mẫu hoàn toàn khi toàn bộ dung dịch trong ống vô cơ hoá mẫu có màu xanh trong suốt.
Bước 3: Chưng cất mẫu
-Lắp ống vô cơ hoá mẫu vào bộ chưng cất, lắp bình hứng chứa 10-60ml H3BO3 4% và 7 giọt dung dịch chỉ thị màu.
-Khởi động máy cất.
-Quá trình chưng cất tiến hành khoảng 390 giây thì toàn bộ khí NH3 chuyển sang bình hứng.
-Khi NH3 được cất hoàn toàn, hạ bình hứng xuống, dùng tia nước cất nhỏ tráng sạch axit dính đầu ống làm lạnh.
Bước 4: Chuẩn độ
Bước 5: Tính kết quả
Ta có 1ml HCl 0,25N tương ứng với 0,0035g N.
Thông qua số ml HCl 0,25N, người ta biết được số lượng axit boric kết hợp với NH3, từ đó biết lượng NH3 giải phóng từ mẫu.
N tổng (%) = (VHCl * 0,35)/ P mẫu
Trong đó: V tính bằng ml
P tính bằng g
Protein tổng (%) = (VHCl * 0,35* 6,25)/ P mẫu
2.2. Một số thiết bị và hoá chất sử dụng
2.2.1 Thiết bị:
- Tủ sấy mẫu
- Máy nghiền mẫu
- Cân phân tích 4 số
- Máy phân tích đạm tự động Kjeldahl
- Thiết bị chuẩn độ
- Máy cất nước 2 lần
2.2.2 Hoá chất:
- Hỗn hợp K2SO4 và CuSO4 theo tỷ lệ 10:1
- Nước cất 2 lần
- NaOH 32%
- H2SO4 đậm đặc
- HCl 0,24N
- Acid Boric 4%
- Chất chỉ thị màu: cách pha:
+ Hoà tan 0,264g methyl đỏ trong 250 ml C2H5OH (cồn tuyệt đối)
+ Hoà tan 1,28g Bromocresol xanh lá cây trong 50ml C2H5OH (cồn tuyệt đối)
+Trộn đều 2 dung dịch trên, bổ sung 96ml HCl 0,25N. Định mức đến 1000ml bằng C2H5OH.
Số lần xem trang : 15475
Nhập ngày : 21-01-2009
Điều chỉnh lần cuối : 23-10-2009 Ý kiến của bạn về bài viết này
Bài giảng  Nội dung thực tập chuyển gen vào tế bào thực vật(03-02-2009)
Phương pháp xác định ẩm độ(21-01-2009) ELISA nâng cao(21-01-2009)
|
Đang xem 2
In trang này
Lên đầu trang
Gởi ý kiến