|
 Nguyễn Minh Nam
 |
Taxol (biệt dược của paclitaxel) là hợp chất được chiết xuất từ cây thông đỏ. Do có khả năng ức chế sự phân rã mạng lưới vi thể của thoi nhiễm sắc, kích thích quá trình ghép các dimer của vi ống thành mạng lưới vi thể và ổn định mạng lưới vi thể bằng cách ngăn chặn quá trình tháo xoắn. Từ đó ức chế sự tái tổ chức năng lượng bình thường của mạng lưới vi thể, một hiện tượng chức năng sống chủ yếu của tế bào trong tiến trình gian kỳ và gián phân. Vì thế Taxol có thể làm gián đoạn sự phân chia và sự phát triển của tế bào, ngăn cản sự phát triển của tế bào ung thư. Kết hợp với đặc tính không gây độc taxol trở thành chất hàng đầu trong điều trị ung thư từ những thập niên 90 và được chỉ định cho bệnh nhân ung thư vú di căn hoặc bệnh nhân ung thư buồng trứng giai đoạn muộn. Nhu cầu về taxol rất lớn mà hàm lượng Taxol trong thiên nhiên có giới hạn. Thực tế cho thấy phải dùng 6 cây thông 100 tuổi mới có đủ lượng Taxol để điều trị cho một bệnh nhân. Hiện nay có năm con đường để công nghiệp hóa sản xuất taxol: chiết tách từ vỏ các loài thông đỏ , tổng hợp toàn phần (1), bán tổng hợp (2-6), nuôi cấy mô, tế bào thực vật (7-13), công nghệ chuyển hóa và lên men nấm nội sinh (14-32). Ở bài này sẽ tập trung vào việc phân lập nấm nội sinh thực tạo taxol, những đóng góp của công nghệ gen và những giới hạn đang gặp phải trong vấn đề sản xuất taxol từ nấm.
1. Phân lập và phát hiện nấm nội sinh thực vật sản xuất taxol
Trong suốt quá trình đồng tiến hóa, mối quan hệ thân thiện đã được hình thành giữa từng sinh vật nội sinh và cây chủ. Một vài sinh vật nội sinh có khả năng sản xuất những hoạt chất như hoặc tương tự với những hợp chất được sinh ra từ cây chủ. Thật vậy, năm 1993 Taxomyces andreanae là nấm nội sinh thực vật (fungal endophyte) đã được phân lập từ mạch libe bên trong vỏ cây thông đỏ Pacific. Nấm này thuộc lớp nấm bất toàn và thuộc nhóm hyphomyceteous, khi được nuôi cấy trên môi trường lỏng bán tổng hợp sẽ sản xuất taxol và các hợp chất liên quan. Taxol đã được phát hiện bằng sắc ký, khối phổ và phản ứng với kháng thể đơn dòng đặc hiệu cho taxol (14). Sau đó, dòng nấm TF5, thuộc Tubercularia sp., được phân lập từ Taxus mairei được nuôi cấy trên môi trường lỏng dextrose khoai tây đã tạo ra được taxol. Chúng có hoạt tính kháng phân bào mạnh khi được thử trên dòng tế bào ung thư P388 và KB. Đồng thời, taxol từ dòng nấm này cũng thúc đẩy sự ổn định của các vi ống (microtube) và kích thích sự polymer hóa invitro tương tự như taxol từ thông đỏ (16).
Fusarium solani được phân lập từ những mẩu thân Taxus celebica sau khi nuôi cấy trên môi trường lỏng có thể sản xuất 1,6ug/l. Paclitaxel được sản xuất từ nấm này gây apoptosiss trên tế bào Jurkat tới 60% trong khi paclitaxel chuẩn chỉ có 51%. Ngoài paclitaxel, nấm này còn sản xuất ra các taxane, baccatin III và 10 deacetyl baccatin III, những tiền chất dùng trong bán tổng hợp paclitaxel công nghiệp (18).
Metarhizium anisopliae, H-27, một trong 13 loài nấm được sàng lọc từ 115 dòng nấm được phân lập từ vỏ cây thông đỏ bắc (Taxus chinensis) có thể sản xuất ra 846,1 μg/ l taxol (29).
Aspergillus candidus MD3 (hình 1) được phân lập từ vỏ Taxus x media có thể tạo ra 112mg/g taxol (tính theo khối lượng khô của sợi nấm) (31). Trong khi đó, dòng Aspergillus niger var. taxi HD86-9 (hình 2) phân lập từ Taxus cuspidata có thể sản xuất 273,46 ug/l (32).
Hình 1: hình thái của Aspergillus candidus MD3. (a) khuẩn lạc sau 14 ngày ở 250C trên môi trường CYA. (b) mặt dưới của khuẩn lạc; (c,d) ảnh dưới kính hiển vi điện tử quét của hạt bào tử ; (e-h) ảnh dưới kính hiển vi của bào tử và cuống bào tử. Độ phóng đại: e 100X; f,g 400X; h 1000X.
Hình 2: hình thái HD86-9. (a) khuẩn lạc trên môi trường PDA ở 280C sau 3 ngày. (b,c) bào tử đính dưới kính hiển vi điện tử quét (2000X và 5000X); (d,e) cuống bào tử dưới kính hiển vi (1000X).
2. Phân lập nấm từ các nguồn khác
Trong khi hầu hết các nghiên cứu đều phân lập nấm nội sinh từ thông đỏ để sản xuất taxol thì Kumaran và cộng sự (2008) lại phân lập nấm Phyllosticta citricarpa (McAlp.) Van der Aa, là loại nấm gây bệnh đốm lá, từ lá cây Citrus medica L. (Rutaceae) bị bệnh ở Chennai, Ấn Độ. Loại nấm này có thể sản xuất lượng taxol khá cao, lên tới 265ug/l trên môi trường M1D, cao hơn 5.3×103 lần so với lượng taxol từ nấm T. andreanae (14) và 137ug/l trên môi trường PDB (potato dextrose broth) (22). Và sau đó ba dòng nấm Phomopsis khác cũng được phân lập từ lá cây Taxus cuspidata (thông đỏ Nhật), Ginkgo biloba (cây bạch quả) và Larix leptolepis (thông rụng lá Nhật). Nấm này có thể tạo 418 ug/l taxol (27). Nấm Phyllosticta tabernaemontanae, nấm đốm lá phân lập từ lá cây Wrightia tinctoria bị bệnh, khi nuôi cấy trên môi trường M1D có thể tạo ra 461 ug/l taxol và 150ug/l trên môi trường PDB (28). Điều này cho thấy nấm sản xuất ra taxol không chỉ được tìm thấy trên thông đỏ mà cả những thực vật khác và đặc biệt bao gồm cả những loài nấm gây bệnh.
Noh và cộng sự (1999) đã phân lập được dòng nấm Pestalotia heterocornis (hình 3) từ đất ở khu rừng trồng thông đỏ (15). Sau khi nuôi cấy trong môi trường bán tổng hợp họ đã thu được 31ug/l paclitaxel sau 5-7 ngày lên men ở 230C.
Hình 3: hình thái bào tử P. heterocornis.
Nấm Chaetomella raphigera (dòng TAC-15) hình 4 được phân lập từ cây dược liệu Terminalia arjuna có thể tạo ra 79.6 μg taxol/L (25) hình. Cũng trên lá cây này Gangadevi và cộng sự đã phân lập được dòng Pestalotiopsis terminaliae có thể tạo ra 211μg/l taxol. Khi thử nghiệm trên các dòng tế bào ung thư người BT220, H116, Int 407, HL 251 và HLK 210 cho thấy hoạt tính kháng phân bào của taxol từ dòng nấm này rất mạnh (26).
Hình 4: (a) Hình thái nấm C. raphigera ; (b) bào tử (40X)
Nấm Pestalotiopsis pauciseta (dòng CHP-11) được phân lập từ lá cây Cardiospermum helicacabum có thể sản xuất 113,3ug/l taxol. Khi kiểm tra trên các trên các dòng tế bào ung thư viz., BT 220, H116, Int 407, HL 251 and HLK 210 cho thấy taxol tạo ra từ nấm này có hoạt tính kháng ung thư rất mạnh thông qua con đường apoptosis (20).
3. Sử dụng công nghệ sinh học trong phân lập, sàng lọc và nâng cao hiệu quả tạo taxol
Các gen mã hóa cho 10-deacetylbaccatin III-10-O-acetyl transferase và C-13 phenylpropanoid side chain-CoA acyltransferase đã được dùng làm marker phân tử để sàng lọc các nấm nội sinh sản xuất taxol. Sau khi sàng lọc 90 dòng nấm được phân lập từ Taxus x media và Taxus yunnanensis bằng kỹ thuật PCR, Zhang và cộng sự (2008) đã tìm ra ba dòng dương tính với hai gen trên. Khi nuôi cấy các dòng này trong 300ml môi trường lỏng dextrose khoai tây ở 25°C sau 10 ngày họ đã thu được từ 100 tới 160ug taxol/g (tính theo trọng lượng khô của sợi nấm thu được sau nuôi cấy) (23). Kết quả cho thấy việc dùng các marker phân tử để sàng lọc sẽ nhanh hơn rất nhiều và dễ dàng chọn lọc được những dòng nấm có khả năng sản xuất taxol cao.
Sử dụng kỹ thuật genome shuffling, Zhao và cộng sự (2008) đã lai tạo được dòng nấm Nodulisporium sylviform sản xuất tới 516.37 μg/L taxol, cao hơn 31.52%–44.72% so với dòng bố mẹ (24).
4. Một số khó khăn và các khía cạnh liên quan trong việc sản xuất taxol từ nấm
Hiện nay các dòng nấm được phân lập chỉ sản xuất Taxol với lượng nhỏ. Đó là nguyên nhân vì sao chưa thể sản xuất taxol công nghiệp từ các dòng nấm này. Một trong những lý do mà taxol thu được không cao là khi taxol tiết ra ở một lượng giới hạn trong môi trường nuôi cấy đã ức chế sự sinh trưởng và tiết taxol từ nấm. Nếu có thể hiểu rõ hơn về con đường ức chế ngược này có thể tìm ra những giải pháp như ức chế các enzyme dẫn truyền tín hiệu gây ức chế này.
Bằng nhiều nỗ lực của mình với mục đích nâng cao hàm lượng taxol từ nấm, qua gần hai thập kỷ kể từ khi dòng nấm sản xuất taxol đầu tiên được phân lập (14), hàm lượng taxol đã được nâng cao đáng kể từ 70ng/l tới 1000ug/l (bảng 1). Nhiều dòng nấm đã được phân lập với hiệu quả ngày càng cao và đặc biệt không chỉ các dòng nội sinh trên thông đỏ mà còn từ đất hay cả những loài thảo dược khác. Đáng lưu ý là hiện nay các dòng được phân lập từ các loài thảo dược lại có khả năng tạo taxol cao hơn rất nhiều so với các dòng được phân lập từ thông đỏ.
Bảng 1: Bảng liệt kê các dòng nấm nội sinh thực vật sản xuất taxol (33).
Nấm nội sinh có thể tạo ra lượng taxol cao tương tự ký chủ, tuy nhiên đây là loài cộng sinh nên với những môi trường phân lập dạng tổng hợp hay bán tổng hợp như hiện giờ cũng khó có thể nuôi cấy và sàng lọc hết những dòng nấm có thể cho sản lượng cao này. Có nghĩa là nhiều dòng vi sinh chưa biết, có tiềm năng tạo taxol cao có thể không được nuôi cấy và sàng lọc.
Mặc dù lượng taxol được sản xuất từ nấm còn thấp so với chiết xuất từ thông đỏ nhưng với tỉ lệ tăng trưởng cao, thời gian sinh trưởng ngắn hơn rất nhiều so với cây thông thì sự nghiên cứu sản xuất taxol từ nấm là việc làm có ý nghĩa. Cùng với thành tựu của công nghệ lên men hiện đại thì hướng nghiên cứu này thực sự mang nhiều hứa hẹn.
Nghiên cứu tổng hợp paclitaxel vẫn đang được các nhóm nghiên cứu trên thế giới tiến hành nhằm tìm ra những con đường bán tổng hợp mới và ngắn hơn cũng như tạo ra những hoạt chất mới dựa trên paclitaxel mà có hoạt tính sinh học cao hơn hoặc /và dễ tổng hợp hơn.
Tài liệu tham khảo
1. Nicolaou, K. C., Yang, Z., Liu, J. J., Ueno, H., Nantermet, P. G., Guy, R. K., Claiborne, C. F., Renaud, J., Couladouros, E. A., Paulvannan, K., and et al. (1994) Total synthesis of taxol, Nature 367, 630-634.
2. Pengsuparp, T., Kingston, D. G., Neidigh, K. A., Cordell, G. A., and Pezzuto, J. M. (1996) Evaluation of the cytotoxic mechanism mediated by baccatin III, the synthetic precursor of taxol, Chem Biol Interact 101, 103-114.
3. Baloglu, E., and Kingston, D. G. (1999) A new semisynthesis of paclitaxel from baccatin III, J Nat Prod 62, 1068-1071.
4. Wuts, P. G. (1998) Semisynthesis of Taxol, Curr Opin Drug Discov Devel 1, 329-337.
5. Walker, K., and Croteau, R. (2000) Taxol biosynthesis: molecular cloning of a benzoyl-CoA:taxane 2alpha-O-benzoyltransferase cDNA from taxus and functional expression in Escherichia coli, Proc Natl Acad Sci U S A 97, 13591-13596.
6. Patel, R. N. (1998) Tour de paclitaxel: biocatalysis for semisynthesis, Annu Rev Microbiol 52, 361-395.
7. Shuler, M. L. (1994) Bioreactor engineering as an enabling technology to tap biodiversity. The case of taxol, Ann N Y Acad Sci 745, 455-461.
8. Zhong, J. J. (2001) Biochemical engineering of the production of plant-specific secondary metabolites by cell suspension cultures, Adv Biochem Eng Biotechnol 72, 1-26.
9. Zhong, J. J. (2002) Plant cell culture for production of paclitaxel and other taxanes, J Biosci Bioeng 94, 591-599.
10. Tabata, H. (2004) Paclitaxel production by plant-cell-culture technology, Adv Biochem Eng Biotechnol 87, 1-23.
11. Tabata, H. (2006) Production of paclitaxel and the related taxanes by cell suspension cultures of Taxus species, Curr Drug Targets 7, 453-461.
12. Georgiev, M. I., Weber, J., and Maciuk, A. (2009) Bioprocessing of plant cell cultures for mass production of targeted compounds, Appl Microbiol Biotechnol 83, 809-823.
13. Fett-Neto, A. G., DiCosmo, F., Reynolds, W. F., and Sakata, K. (1992) Cell culture of Taxus as a source of the antineoplastic drug taxol and related taxanes, Biotechnology (N Y) 10, 1572-1575.
14. Stierle, A., Strobel, G., and Stierle, D. (1993) Taxol and taxane production by Taxomyces andreanae, an endophytic fungus of Pacific yew, Science 260, 214-216.
15. Noh, M. J., Yang, J. G., Kim, K. S., Yoon, Y. M., Kang, K. A., Han, H. Y., Shim, S. B., and Park, H. J. (1999) Isolation of a novel microorganism, pestalotia heterocornis, producing paclitaxel, Biotechnol Bioeng 64, 620-623.
16. Wang, J., Li, G., Lu, H., Zheng, Z., Huang, Y., and Su, W. (2000) Taxol from Tubercularia sp. strain TF5, an endophytic fungus of Taxus mairei, FEMS Microbiol Lett 193, 249-253.
17. Zhou, X., Wang, Z., Jiang, K., Wei, Y., Lin, J., Sun, X., and Tang, K. (2007) Screening of taxol-producing endophytic fungi from Taxus chinensis var. mairei, Prikl Biokhim Mikrobiol 43, 490-494.
18. Chakravarthi, B. V., Das, P., Surendranath, K., Karande, A. A., and Jayabaskaran, C. (2008) Production of paclitaxel by Fusarium solani isolated from Taxus celebica, J Biosci 33, 259-267.
19. Engels, B., Dahm, P., and Jennewein, S. (2008) Metabolic engineering of taxadiene biosynthesis in yeast as a first step towards Taxol (Paclitaxel) production, Metab Eng 10, 201-206.
20. Gangadevi, V., Murugan, M., and Muthumary, J. (2008) Taxol determination from Pestalotiopsis pauciseta, a fungal endophyte of a medicinal plant, Sheng Wu Gong Cheng Xue Bao 24, 1433-1438.
21. Hao da, C., Ge, G. B., and Yang, L. (2008) Bacterial diversity of Taxus rhizosphere: culture-independent and culture-dependent approaches, FEMS Microbiol Lett 284, 204-212.
22. Kumaran, R. S., Muthumary, J., and Hur, B. K. (2008) Taxol from Phyllosticta citricarpa, a leaf spot fungus of the angiosperm Citrus medica, J Biosci Bioeng 106, 103-106.
23. Zhang, P., Zhou, P. P., Jiang, C., Yu, H., and Yu, L. J. (2008) Screening of Taxol-producing fungi based on PCR amplification from Taxus, Biotechnol Lett 30, 2119-2123.
24. Zhao, K., Ping, W., Zhang, L., Liu, J., Lin, Y., Jin, T., and Zhou, D. (2008) Screening and breeding of high taxol producing fungi by genome shuffling, Sci China C Life Sci 51, 222-231.
25. Gangadevi, V., and Muthumary, J. (2009) A novel endophytic Taxol-producing fungus Chaetomella raphigera isolated from a medicinal plant, Terminalia arjuna, Appl Biochem Biotechnol 158, 675-684.
26. Gangadevi, V., and Muthumary, J. (2009) Taxol production by Pestalotiopsis terminaliae, an endophytic fungus of Terminalia arjuna (arjun tree), Biotechnol Appl Biochem 52, 9-15.
27. Kumaran, R. S., and Hur, B. K. (2009) Screening of species of the endophytic fungus Phomopsis for the production of the anticancer drug taxol, Biotechnol Appl Biochem 54, 21-30.
28. Kumaran, R. S., Muthumary, J., and Hur, B. K. (2009) Isolation and identification of an anticancer drug, taxol from Phyllosticta tabernaemontanae, a leaf spot fungus of an angiosperm, Wrightia tinctoria, J Microbiol 47, 40-49.
29. Liu, K., Ding, X., Deng, B., and Chen, W. (2009) Isolation and characterization of endophytic taxol-producing fungi from Taxus chinensis, J Ind Microbiol Biotechnol 36, 1171-1177.
30. Staniek, A., Woerdenbag, H. J., and Kayser, O. (2009) Taxomyces andreanae: a presumed paclitaxel producer demystified?, Planta Med 75, 1561-1566.
31. Zhang, P., Zhou, P. P., and Yu, L. J. (2009) An endophytic taxol-producing fungus from Taxus x media, Aspergillus candidus MD3, FEMS Microbiol Lett 293, 155-159.
32. Zhao, K., Ping, W., Li, Q., Hao, S., Zhao, L., Gao, T., and Zhou, D. (2009) Aspergillus niger var. taxi, a new species variant of taxol-producing fungus isolated from Taxus cuspidata in China, J Appl Microbiol 107, 1202-1207.
33. Zhou, X., Zhu, H., Liu, L., Lin, J., and Tang, K. (2010) A review: recent advances and future prospects of taxol-producing endophytic fungi, Appl Microbiol Biotechnol 86, 1707-1717. Số lần xem trang : 14952
Nhập ngày : 14-07-2011
Điều chỉnh lần cuối : 08-08-2012 Ý kiến của bạn về bài viết này
 Tam giác Nano bạc bọc chitosan, tiền năng trong điều trị ung thư(27-06-2011)
Tinh dầu cá và tinh dầu lưu ly có thể giảm viêm và loãng xương(18-06-2011) Tác dụng chống ung thư gan của Cannabinoids từ cây cần sa (17-06-2011) Tạo tế bào thần kinh từ tế bào thường(08-06-2011) Tầm nhìn phát triển vaccine chống HIV, lao và sốt rét tới năm 2020(05-06-2011) Các RNA không mã hóa protein: một thế giới rộng lớn và tiềm ẩn(23-05-2011) Cách pha primer(01-06-2009) Bệnh vàng gân lá trên mía và sugarcane yellow leaf virus(05-03-2009) Một số bệnh do virus trên cây mía(05-03-2009) Trang kế tiếp ...
|
Đang xem 16
In trang này
Lên đầu trang
Gởi ý kiến